Синдром диабетической стопы (СДС) является поздним осложнением сахарного диабета и характеризуется наличием хронических длительно незаживающих язвенных дефектов на фоне снижения чувствительности и/или магистрального кровотока. Одной из причин хронического течения и выполнения высоких ампутаций нижних конечностей является инфицирование раны [1]. Состав микрофлоры язвенного дефекта зависит от формы и глубины поражения, предшествующей антибактериальной терапии, местного консервативного лечения, длительности пребывания в стационаре. Так, при поверхностно расположенных язвенных дефектах, возникших впервые, преобладают грамположительные кокки (S. aureus, В-hemolytic streptococcus) [2, 3]. При длительно существующих хронических язвенных дефектах, подвергавшихся системному антибактериальному лечению и местной терапии, в них могут содержаться резистентные к антибиотикам микроорганизмы, грамотрицательные бациллы (Enterobacteriacea). При наличии неприятного запаха состав микрофлоры смешанный - аэробно-анаэробный [4, 5] . Традиционным методом диагностики состава патогенной микрофлоры язвенного дефекта является посев раневого содержимого на культуральные среды. Это полуколичественный метод, позволяющий выявить патогенный микроорганизм или микроорганизмы и определить чувствительность полученного патогена к антибиотикам. При этом у данной методики есть ряд недостатков: для получения анализа требуется от 3 до 10 сут, есть ограничения в диагностике анаэробных микроорганизмов, нет возможности выявлять наличие и состав биопленок. В этой связи диагностика микробного состава хронических ран альтернативными способами является достаточно актуальной задачей. Одним из методов, позволяющих дать качественную и количественную оценку микробиологического состава раневого содержимого, является масс-спектрометрия. Она основана на выявлении видоспецифичных структур микроорганизма. Это могут быть белковые компоненты или длинноцепочечные жирные кислоты и жирные альдегиды фосфолипидов, являющихся маркерами конкретного микроба [6].
Цель данной работы - изучение микробного состава хронических язвенных дефектов при СДС методом масс-спектрометрии различных микробных маркеров (МСММ) и сравнение полученных данных с результатами посева на культуральные среды.
Материал и методы
Исследовали 17 образцов раневого содержимого хронических язвенных дефектов у пациентов с СДС, получавших амбулаторное лечение в отделении "Диабетическая стопа" ГБУЗ "Эндокринологический диспансер" Департамента здравоохранения г. Москвы.
Критерии включения
1. Больные сахарным диабетом типа 1 или 2.
2. Возраст ≥18 лет.
3. Наличие язвенного дефекта на стопе в пределах кожи и/или подкожной клетчатки (I и II степени по Вагнеру).
4. Лодыжечно-плечевой индекс >0,8.
5. Способность и желание выполнять рекомендации врача.
6. Подписанное информированное согласие.
Критерии невключения
1. Наличие признаков инфекционного процесса в ране, требующих госпитализации и/или системной антимикробной терапии: лихорадки, гиперемии, распространяющейся более чем на 2 см, отделяемого гнойного характера, неприятного запаха из раны.
2. Наличие признаков критической ишемии конечности.
3. Наличие остеомиелита.
4. Раны, расположенные в средней части подошвенной поверхности стопы на фоне нейроостеоартропатии.
5. Рана, покрытая струпом и/или фибрином.
6. HbA1c >11%.
7. Несоблюдение рекомендаций врача.
Таким образом, исследовались образцы, взятые из язвенных дефектов без признаков инфицирования и не требующие назначения системных антимикробных средств.
После очищения раны от некротических масс и промывания физиологическим раствором содержимое с поверхности язвенного дефекта отправлялось в микробиологическую лабораторию ГБУЗ "Диагностический центр № 1 ДЗМ" для посева на культуральные среды и определения чувствительности к антибиотикам.
Из этой же раны забирался материал для выполнения МСММ содержимого по белковым маркерам микроорганизмов в лабораторию ООО НПЦ "МикроМир" (Москва). Производился посев клинического материала на плотные питательные среды - cердечно-мозговой агар с 5% бараньей кровью (BHI) для выделения бактерий Streptococcus, Corynebacterium, Arcanobacterium, Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Actinomyces; желточно-солевой агар с маннитом для выделения и дифференциации стафилококков; диагностическую среду Эндо для выделения Enterobacteriaceae и Pseudomonas, среду Сабуро с хлорамфениколом для выделения дрожжей и микромицетов; на BHI с 5% бараньей крови и агар Шедлера для выделения облигатно-анаэробных бактерий Clostridium, Propionibacterium, Bacteroides, Fusobacterium.
Засеянные плотные питательные среды инкубировали при 37 °C в течение 18-24 ч. При обнаружении роста производили отсев отдельных колоний с целью их идентификации. Отмечали морфологию колоний, наличие гемолиза, рост микроорганизмов в виде монокультуры или в ассоциации. При обнаружении ассоциации на плотной питательной среде отмечали преимущественный рост какого-либо представителя ассоциации.
При отсутствии роста в аэробных условиях в первые сутки посевы оставляли в термостате, ежедневно просматривали и при визуальном обнаружении роста также производили соответствующие отсевы. Ответ об отсутствии роста выдавали через 5 сут инкубирования.
Засеянные плотные питательные среды в анаэробных условиях (в анаэростатах с газогенерирующими пакетами "Анаэрогаз") инкубировали при 37°C в течение 48 ч. При отсутствии роста оставляли в термостате, также ежедневно просматривали и при визуальном обнаружении роста производили соответствующие отсевы. Ответ об отсутствии роста выдавали через 10 сут инкубирования.
Полученные чистые культуры микроорганизмов микроскопировали, отмечали принадлежность к определенной группе или роду и производили экстракцию этанолом/муравьиной кислотой для последующей идентификации методом масс-спектрометрии на масс-спектрометре (MALDI-TOF).
Результаты
Посев на культуральные среды отделяемого из язвенных дефектов, не имеющих клинических признаков инфекции, выявил контаминацию (количество микроорганизмов не превышало 106) преимущественно грамположительных кокков, включая резистентные штаммы S. aureus (MRSA), незначительное количество грамотрицательных палочек и факультативных анаэробов. В 2 (11%) случаях роста микроорганизмов не выявлено. В 6 (33%) случаях выявлено наличие более одного микроба (табл. 1). Облигатные анаэробы не обнаружены. В одном случае выявлены Candida glabrata. В 2 случаях содержание коагулазонегативных стафилококков составило 106. Таким образом, показано, что хронические длительно незаживающие раны не содержали патогенной микрофлоры в количествах, превышающих критическую колонизацию [7].
&hide_Cookie=yes)
Метод МСММ, основанный на определении белковых компонентов микроорганизма, позволил идентифицировать большее количество микроорганизмов в тех же образцах (табл. 2). В 13 (76%) образцах выявлена полимикробная флора, в 2 (12%) случаях роста микроорганизмов не обнаружена. Наиболее часто высеваемым микробом был Staphylococcus aureus - как единственный возбудитель (1 случай) и в составе полимикробной инфекции (9 образцов). В 1 (6%) случае был выявлен факультативный анаэроб Klebsiella pneumoniae.
&hide_Cookie=yes)
В табл. 3 представлена сравнительная характеристика образцов, исследованных разными методами: культуральным и МСММ по белковым маркерам. В большинстве случаев высеваемый традиционным методом микроорганизм выявлялся и методом МСММ, но в составе полимикробной микрофлоры. В одном случае метициллин-резистентный Staphylococcus aureus, выделенный традиционным методом, не был выявлен методом МСММ. При этом в образце с отсутствующим ростом посева на культуральные среды метод МСММ выявил полимикробную флору, состоящую из грамположительных кокков и грамотрицательных палочек. В 2 случаях с отсутствующим ростом методом МСММ, традиционным методом были выявлены грамположительные кокки, относящиеся к сапрофитной флоре (Staphylococcus epidermidis <102 КОЕ/мл, Staphylococcus auricularis - 106 КОЕ/мл). Следует отметить, что метод МСММ не дает возможности точного количественного определения микроорганизмов, в отличие от традиционного метода.
&hide_Cookie=yes)
Обсуждение
Длительно незаживающие язвенные дефекты при нейропатической форме СДС являются актуальной проблемой. Одна из возможных причин замедления или отсутствия заживления - наличие инфекции, обусловливающей хронизацию процесса. При этом характерной особенностью таких ран (по собственным данным и данным литературы) является отсутствие явных клинических признаков инфекции [8, 9]. В данной работе в посевах на культуральные среды была выявлена колонизация бактерий. В большинстве случаев высевался St. aureus, включая MRSA, что совпадает с результатами, полученными другими авторами [10, 11]. В 33% случаев была выявлена полимикробная флора, состоящая из грамположительных кокков, грамотрицательных палочек, факультативных анаэробов и грибковой инфекции. Изолированные грамотрицательные палочки получены только в двух случаях. Во всех образцах рост микрофлоры не превышал значений, соответствующих микробной контаминации [7]. В такой ситуации антимикробная терапия не назначается. Однако в последнее время появились данные, подтверждающие важную роль бактериальной колонизации в замедлении процесса заживления [12, 13]. Остается неясным вопрос о лечебной тактике в этих случаях в плане назначения системных антимикробных препаратов и выбора перевязочных средств.
Известно, что посев содержимого раневых дефектов на культуральные среды имеет ряд ограничений: небольшое количество микроорганизмов, способных расти в чашках Петри на агаре, сложности в выявлении редких бактерий и бактерий, входящих в состав биопленок [6, 14]. Между тем микрофлора, покрывающая кожу и слизистые и образующая микробиоту, содержит большое количество микроорганизмов и при определенных условиях может играть важную роль не только в инфицировании ран, но и в развитии хронических заболеваний. В частности, прослежена взаимосвязь дисбаланса микробиоты кишечника в возникновении ожирения [15, 16], инфекционно-аллергических заболеваний [17], сахарного диабета типа 1 [18], воспалительных заболеваний желчного пузыря [19]. В этой связи в последнее время разрабатываются новые методы, позволяющие идентифицировать микроорганизмы, составляющие микробиоту и входящие в состав биологических сред (кровь, спинномозговая и синовиальная жидкости) и раневого содержимого.
Среди таких методов следует назвать масс-спектрометрию раневого экссудата по различным видоспецифичным маркерам. Особенностью нашей работы было отсутствие клинических признаков инфицирования длительно незаживающих ран при СДС. Метод МСММ по белковым фрагментам позволяет идентифицировать микроорганизмы после предварительного культивирования. Как продемонстрировал сравнительный анализ с традиционным методом, МСММ по белковым маркерам способен идентифицировать большее количество микроорганизмов. Полученные данные дают основание предположить, что раневой экссудат хронических ран без признаков инфицирования содержит в большинстве случаев ассоциации микроорганизмов. Вопрос о том, соединены выявленные микроорганизмы в биопленки или функционируют отдельно друг от друга, остается открытым.
В результате проделанной работы получены новые данные о микробиологическом составе хронических ран при СДС. Вклад выявленных сообществ микроорганизмов в процесс заживления требует отдельного изучения. Есть мнение, что речь идет не о влиянии конкретного патогена (или патогенов) на процесс заживления, а о комплексном воздействии консорциума микроорганизмов, существующих в виде хорошо структурированных сообществ [6]. Эти сообщества состоят из бактерий, простейших, вирусов и грибов [20, 21] и отражают специфические взаимоотношения друг с другом и с организмом хозяина [22]. Необходимы дальнейшие исследования по изучению влияния выявленных микробных ассоциаций на течение раневого процесса и применению метода МСММ в клинической практике.
Выводы
1. Микробиологический состав длительно незаживающих язвенных дефектов у больных с синдромом диабетической стопы без признаков инфекции при использовании традиционного метода посева на культуральные среды представлен грамположительными кокками (45% случаев), грамотрицательными палочками (11% случаев), наличием более чем одного микроорганизма (33% случаев) в количествах, не превышающих колонизации микроорганизмов (≤106).
2. Метод масс-спектрометрии микробных маркеров по белковым фрагментам позволяет идентифицировать в отделяемом из длительно незаживающих язвенных дефектов у больных с СДС наличие полимикробной флоры в 76% случаев, включающей в себя грамположительные кокки, грамотрицательные палочки, факультативные анаэробы. В 6% случаев микрофлора была представлена одним микроорганизмом. Отсутствие роста обнаружено в 12% случаев.
3. Применение масс-спектрометрии по белковым маркерам может дополнять арсенал диагностических методов исследования микробиологического содержимого хронических длительно незаживающих ран при СДС.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Lipsky B.A., Berendt A.R., Cornia P.B., Pile J.C. et al. Clinical Practice Guideline for the Diagnosis and Treatment of Diabetic Foot Infections // Clin. Infect. Dis. 2012. Vol. 54, N 12. P. 132-173.
2. Abdularazak A., Bitar Z.I., Al-Shamali A.A. et al. Bacteriological study of diabetic foot infections // J. Diabetes Complicat. 2005. Vol. 19. P. 138-141.
3. Lavery L.A., Sariaya M., Ashry H. Microbiology of osteomyelitis in diabetic foot infections // J. Foot Ankle Surg. 1995. Vol. 34, N 1. P. 61-64.
4. Goldberg D., Harold C. Infectious disease of the diabetic foot // Management of the Diabetic Foot / ed. M.A. Brenner. 1992.
5. Lipsky B. Evidence-based antibiotic therapy of diabetic foot infections // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1999. Vol. 26. P. 267-276.
6. Lavigne J.-P., Sotto A., Dunyach-Remy C., Lipsky B. New molecular techniques to study the skin microbiota of diabetic foot ulcers // Adv. Wound Care. 2015. Vol. 4, N 1. P. 38-49.
7. Галстян Г.Р., Токмакова А.Ю., Егорова Д.Н., Митиш В.А. и др. Клинические рекомендации по диагностике и лечению синдрома диабетической стопы // Раны и раневые инфекции. 2015. № 3. С. 63-84.
8. Lavery L.A., Armstrong D.G., Wunderlich R.P., Mohler M.J. et al. Risk factors for foot infections in individuals with diabetes // Diabetes Care. 2006. Vol. 29, N 6. P. 1288-1293.
9. Bjarnsholt T., Kirketerp-Moller M.J., Jensen P.Q., Madsen K.G. et al. Why chronic wounds will not heal: a novel hypothesis // Wound Repair Regen. 2008. Vol. 16, N 1. P. 2-10.
10. Dang C., Prasad Y., Boulton A., Jude E. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in the diabetic foot clinic: a worsaring problem // Diabet. Med. 2003. Vol. 20, N 2. P. 159-161.
11. Citron D.M., Goldstein E.J., Merriam C.V., Lipsky B.A. et al. Bacteriology of moderate-to-severe diabetic foot infections and in vitro activity of abtimicrobal agents // J. Clin. Microbiol. 2007. Vol. 45, N 9. P. 2819-2828.
12. Robson M.C. Wound infection: a failure of wound healing caused by an imbalance of bacteria // Surg. Clin. North Am. 1997. Vol. 77, N 3. P. 637-650.
13. Xu L., McLennan S.V., Lo L., Natfaji A. et al. Bacterial load predicts healing rate in neuropathic diabetic foot ulcers // Diabetes Care. 2007. Vol. 30, N 2. P. 378-380.
14. van Asten S.A.V., La Fontaine J., Peters E.J.G., Bhavan K. et al. The microbiome of diabetic foot osteomyelitis // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2016. Vol. 35. P. 293-298.
15. Ley R.E., Turnbaugh P.J., Klein S., Gordon J.I. Microbal ecology: human gut microbes associated with obesity // Nature. 2006. Vol. 444. P. 1022-1023.
16. Armougom F., Henry M., Vialettes B., Raccah D., Raoult D. Monitoring bacterial community of human gut microbiota reveals an increase in Lactobacillus in obese and Methanogenes in anorexic patients // PLoS One. 2009. Vol. 4. Article ID e7125.
17. Bach J.F. The effect of infections on susceptibility to autoimmune and allergic disease // N. Engl. J. Med. 2002. Vol. 347. P. 911-920.
18. Wen L., Ley R.E., Volchkov P.Y. et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes // Nature. 2008. Vol. 455. P. 1109-1113.
19. Baumgart D.C., Carding S.R. Inflammatory bowel disease: cuase and immunobiology // Lancet. 2007. Vol. 369, N 9573. P. 1627-1640.
20. Wolcott R.D., Gontcharova V., Sun Y., Dowd S.E. Evaluation of the bacterial diversity among and within individual venous leg ulcersusing bacterial tag-encoded FLX and titanium ampliconpyrosequencing and metagenomic approaches // BMC Microbiol. 2009. Vol. 9. P. 226.
21. James A., Swogger E., Wolcott R. et al. Biofilms in chronic wounds // Wound Repair Regen. 2006. Vol. 16. P. 37-44.
22. Peters B.M., Jabra-Rizk M.A., O'May G.A. et al. Polymicrobial interactions: impact on pathogenesis and human disease // Clin. Microbiol. Rev. 2012. Vol. 25. P. 193-213.